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海洋来源小单孢菌SCSIO 04089聚酮化合物nenestatin A生物合成中调控与后修饰基因功能研究
蒋晓东
Subtype硕士
Thesis Advisor张长生,朱义广
2017-05-30
Degree Discipline海洋生物学
Keyword海洋来源放线菌 非典型角环素类化合物 生物合成 调控基因 天然产物
Abstract非典型角环素类化合物通过II型聚酮合酶(PKS)途径合成,是一类结构复杂和活性多样的天然产物。前期研究中,课题组从海洋来源小单孢菌Micromonospora echinospora SCSIO 04089中分离得到非典型角环素类化合物nenestatin A;通过基因组扫描、生物信息学分析鉴定了nenestatin A的生物合成基因簇,并构建了部分基因敲除突变株。 前期研究发现在构建的nenestatin A生物合成基因簇突变株中,绝大多数没有累积代谢中间产物,为详细阐述nenestatin A的生物合成机制带来了困难。本论文在此基础上,以海洋来源小单孢菌M. echinospora SCSIO 04089及其突变株为研究对象,通过优化发酵培养条件,构建同框缺失突变株和超量表达正调控基因等方法,提高突变株合成中间体的的产量;通过体内缺失和体外生化实验,研究后修饰基因的功能,揭示nenestatin A的生物合成机制,取得的结果总结如下: 1.通过对菌株M. echinospora SCSIO 04089进行培养基组分的筛选和盐度优化,确定菌株M. echinospora SCSIO 04089最佳发酵培养基为N4培养基,并且盐度为30‰时次级代谢产物产量最高。 2.采用优化后的培养基对Δnes27、Δnes40和Δnes49进行发酵,HPLC检测发现Δnes40和Δnes27中有明显的次级代谢产物积累,Δnes49的代谢产物变化不显著。对Δnes27进行放大发酵,并从中分离得到了化合物homo-dehydro-rabelomycin E (2)。 3.体外表达蒽酮氧化酶基因nes27,以homo-dehydro-rabelomycin E为底物进行功能验证,发现酶Nes27能够将底物homo-dehydro-rabelomycin E (2)转化生成多个产物。4.构建糖基转移酶基因nes40和nes49同框缺失的突变株;发酵后HPLC检测发现,突变株Δnes49i仍没有明显的代谢产物积累。 5.根据生物信息学分析,在化合物nenestatin A生物合成基因簇中存在3个调控基因。通过体内基因敲除,获得了nes6、nes7和nes58的基因缺失突变株,发酵产物经HPLC分析发现,基因nes6缺失后失去了合成nenestatin A类化合物的能力,基因nes7缺失后,尽管其突变株仍能够合成nenestatin A类化合物,但是产量降低,结果表明基因nes6和nes7均为正调控基因。Δnes58不仅能够合成nenestatin A类化合物,而且化合物的产量得到了提高,表明基因nes58为负调控基因。
Document Type学位论文
Identifierhttp://ir.scsio.ac.cn/handle/344004/17404
Collection学位论文(硕士)
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GB/T 7714
蒋晓东. 海洋来源小单孢菌SCSIO 04089聚酮化合物nenestatin A生物合成中调控与后修饰基因功能研究[D],2017.
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