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石斑鱼三个泛素蛋白酶体相关基因的克隆及功能分析
杨莹
Subtype硕士
Thesis Advisor黄晓红,黄友华
2017-05-25
Degree Discipline海洋生物学
Keyword石斑鱼 Trim25 Trim62 Usp14 病毒复制
Abstract石斑鱼是我国南方沿海各省、香港和台湾地区以及东南亚各国最名贵的海水养殖鱼类之一,经济价值极高。但病害频繁发生严重制约着石斑鱼养殖业健康可持续发展,其中以石斑鱼虹彩病毒和神经坏死病毒病毒为主要病原的病毒性疾病更是给石斑鱼养殖带来了重大经济损失。因此,研究石斑鱼自身免疫相关基因及其抗病机制,研制抗病功能制品,对石斑鱼的健康养殖十分重要。 泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-proteasome system,UPS)是真核生物降解蛋白质的一种主要途径, 在许多生物学过程中发挥重要作。三重基序蛋白TRIM(Tripartite motif protein)是一类新的RING(Really Interesting New Gene)指泛素连接酶,在天然免疫反应中发挥着重要作用,参与细胞凋亡、周期调控、细胞对病毒的免疫应答等重要的生命过程。泛素特异性蛋白酶USP(Ubiquitin-specific protease)是蛋白酶体去泛素化酶的一个家族,USP14是主要的去泛素化酶之一,它与趋化因子受体信号转导、病毒感染、免疫应答有关。目前,对这些基因功能的研究主要来源于哺乳动物,对鱼类相关基因的研究报道甚少。本论文首次对石斑鱼TRIM25,TRIM62及USP14基因进行了克隆与功能分析,取得了如下研究成果: 1、运用RACE技术,从石斑鱼脾组织中克隆获得TRIM25的全长cDNA。EcTRIM25 的cDNA全长为3211bp, 编码734个氨基酸。进化分析表明EcTRIM25基因与大黄鱼TRIM25在同一分支。结构预测结果表明EcTRIM25含有RING、B box/coiled-coil 和SPRY三个保守的结构域。TRIM25在脾和皮肤组织中表达量最高,肾和头肾组织中表达量次之。在polyI:C和SGIV(Singapore grouper iridovirus)刺激下,石斑鱼脾细胞(GS)中EcTRIM25的相对表达量在刺激早期有显著的升高,推测TRIM25参与宿主固有免疫对病毒的应答。亚细胞定位结果显示EcTRIM25主要定位在细胞质中,缺失RING结构域影响其精准定位。过表达EcTRIM25能抑制SGIV和RGNNV(red spotted grouper nervous necrosis virus)感染的CPE(cytopathic effect)进程,且降低了SGIV病毒主要衣壳蛋白MCP(major capsid protein),VP19和RGNNV病毒的CP(coat protein)和RdRp的表达。过表达EcTRIM25能促进干扰素相关分子IRF3(interferon regulatory factor)、IRF7、IFP35(interferon-induced 35-kDa protein)、MXI 和 MyD88(myeloid differentiation factor 88)的mRNA表达量,推测这是抑制RGNNV复制的主要原因。EcTRIM25过表达对促炎因子也有不同的调节作用,推测其对IRF7、 MyD88和促炎因子的调节影响SGIV复制,RING结构域对其抗病毒作用是必须的。 2、运用RACE技术,从石斑鱼脾组织中克隆获得TRIM62的全长cDNA。该基因cDNA编码475个氨基酸。EcTRIM62与二色小热带鱼TRIM62有99%的同源性,与人类有83%的同源性。氨基酸序列结构预测结果表明TRIM62含有RING、B box/coiled-coil 和SPRY三个保守的结构域。 EcTRIM62基因组织表达谱分析表明其在脑,肝中表达量最高,其次是心、皮、脾等。polyI:C刺激后EcTRIM62相对表达量在6h时下降至19.4%。不同的是,在SGIV刺激后,早期表达量降低,24h时候升高至2.19倍,推测TRIM62参与了石斑鱼固有免疫的抗病毒应答。过表达EcTRIM62能显著促进RGNNV和SGIV病毒的复制,且对干扰素信号相关因子和促炎因子都有负调控作用,且EcTRIM62能够调控MDA5(melanoma differentiation-associated protein 5)介导的干扰素免疫应答,而SPRY结构域在该基因的功能中起关键性的作用。利用流式细胞仪检测EcTRIM62对GS细胞DNA含量的影响,结果表明:与对照组相比,过表达EcTRIM62能够导致G0/G1(二倍体峰)期的细胞增多,而S期和G2/M(四倍体峰)期的细胞减少,缺失SPRY结构域后对周期影响不明显。我们的研究首次证明EcTRIM62可以负调控免疫应答从而促进鱼类病毒的复制。 3、通过PCR技术从石斑鱼脾组织中获得了石斑鱼USP14的cDNA,EcUSP14与其他物种同源性非常高,与斑马鱼有95%的同源性。进化分析发现它与哺乳动物在不同分支,与斑马鱼亲缘关系最近。亚细胞定位结果表明其在细胞质中分布。EcUSP14在鳃中表达量最高,在脾和皮肤中表达量次之,表明USP14可能与机体免疫有关。过表达EcUSP14能降促进SGIV 病毒基因MCP,VP19的表达。并且能抑制NF-κB,IFN和ISRE启动子活性。 以上研究结果表明TRIM25、TRIM62和USP14在病毒感染的免疫反应中发挥了重要的作用。这不仅丰富了石斑鱼先天性免疫的内容,也为进一步探索石斑鱼免疫机制及疾病防治提供新的策略和理论依据。
Document Type学位论文
Identifierhttp://ir.scsio.ac.cn/handle/344004/17420
Collection学位论文(硕士)
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GB/T 7714
杨莹. 石斑鱼三个泛素蛋白酶体相关基因的克隆及功能分析[D],2017.
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