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粤蓝链霉菌隐蔽生物合成基因簇的激活及其次级代谢产物研究
林海州
学位类型硕士
导师朱红惠
2017-07-02
学位专业生物工程
关键词隐蔽次级代谢产物 “移树养苗”策略 激活 多重耐药菌 粤蓝链霉菌
摘要微生物隐蔽次级代谢产物生物合成基因簇的激活是当前面临的重要挑战。本研究在前人研究的基础上系统地总结和阐述了一种效率有所提高的激活策略——“移树养苗”策略,并将其应用于粤蓝链霉菌隐蔽次级代谢产物的挖掘。该菌是本研究室近年命名的一株链霉菌新种,其主导产物是具有抗菌、抗肿瘤活性的榴菌素。其突变株DMR1的榴菌素关键生物合成基因gra-orf1,2,3被敲除。 通过改变营养条件、添加诱导物和热激等方法对突变株DMR1进行发酵,发现其高氏一号和ISP3培养基发酵粗提物对所有受试的革兰氏阳性普通菌和耐药菌均具有显著抑菌活性;添加3%DMSO诱导后,上述两种培养基的发酵粗提物不仅对以上菌株的抑制活性增强,还具有抑制革兰氏阴性普通菌和耐药菌以及白色念珠菌ATCC 10231的活性。以枯草芽孢杆菌ATCC 6633为指示菌,以高氏一号为培养基,设置3因素3水平正交试验对发酵条件进行优化。结果显示,当DMSO添加量为1%,添加时间为6 h,热激温度30℃时,发酵粗提物抑菌活性最大。以该优化的条件对突变株DMR1进行发酵,并用正相与反相硅胶柱、Sephadex LH20凝胶柱和HPLC等方法从发酵粗提物中分离到12单体,利用NMR和MS等波谱方法鉴定了5个化合物,分别为:榴菌素(1),4,5-Dihydroxyhexanoic acid γ-lactone(2),N-苯乙基乙酰胺(3),N-[2-(4-Hydroxyphenyl)ethyl]acetamide(4),Cyclo-(Pro-Phe)(5)。 对突变株DMR1仍能产生微量榴菌素的现象进行了确证。用稀释涂布法对突变株DMR1进一步分离纯化,纯化后菌株发酵产物中仍能检测到榴菌素的存在;PCR检测和克隆测序都表明突变株DMR1的基因型与预期相符,且未受到野生型的污染,提示所分离鉴定的榴菌素确为突变株DMR1所产生。基于基因组测序分析和相关文献推测,突变株DMR1产生微量榴菌素的原因可能是孢子色素基因簇与榴菌素基因簇之间发生了串扰。 利用核糖体工程获得利福平或链霉素抗性菌株共5株。其中利福平抗性菌株R25-2在高氏一号中的发酵产物产量、丰富度和抗菌活性均高于出发菌株,提示其次级代谢能力从整体上获得提升。
文献类型学位论文
条目标识符http://ir.scsio.ac.cn/handle/344004/17435
专题学位论文(硕士)
推荐引用方式
GB/T 7714
林海州. 粤蓝链霉菌隐蔽生物合成基因簇的激活及其次级代谢产物研究[D],2017.
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