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深海链霉菌Streptomyces sp. SCSIO 03032中色氨酸二聚体生物合成后修饰基因的鉴定和功能研究
Alternative TitleInvestigation of Tailoring Modifications for Tryptophan Dimers Biosynthesis in Deep Sea-Derived Streptomyces sp. SCSIO 03032
马亮
Thesis Advisor张长生,朱义广
2018
Degree Grantor南海海洋研究所
Degree Name博士
Degree Discipline海洋生物学
Keyword色氨酸二聚体,Spiroindimicins,Indimicins,生物合成,甲基转移酶
Abstract氨酸二聚体(Tryptophan Dimers, TDs)是一类重要的微生物次级代谢产物,因具有良好的生物学活性和药理活性受到广泛关注,代表化合物N-苯甲酰-星形孢菌素(midostaurin)已被批准用于治疗FLT3阳性的急性骨髓性白血病。Spiroindimicins和indimicins是一类具有中等抗肿瘤活性的TDs,分离自深海来源的链霉菌Streptomyces sp. SCSIO 03032。与已报道的250多种TDs不同的是,spiroindimicins的双吲哚形成了独特的螺环结构,其中spiroindimicin A为5-6螺环,spiroindimicins B - D为5-5螺环,而indimicins结构中的一个吲哚环被甲基化而破坏了其芳香性。本人硕士期间克隆鉴定了深海链霉菌Streptomyces sp. SCSIO 03032中TDs生物合成基因簇(spm),通过基因敲除对其生物合成途径进行了初步研究,推测chromopyrrolic acid为其生物合成中间体。在此基础上,博士期间主要对spiroindimicins和indimicins生物合成后修饰基因进行了鉴定和功能研究,基本解析了从chromopyrrolic acid到spiroindimicins和indimicins的生物合成过程。取得了如下研究成果:(1)将spm基因簇克隆至大肠杆菌E. coli BL21(DE3)和天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor YF11中进行表达,并从链霉菌异源表达工程菌株中分离获得4个TDs同系物9 - 12。将这些同系物喂养至丧失TDs生产能力的ΔspmO突变株,使其恢复了生产spiroindimicins的能力。随后,结合同位素喂养,基因簇异源表达和生物信息学分析,初步定位了分散在基因组不同位置的6个甲基转移酶,参与spiroindimicins和indimicins后修饰过程。分别对这6个甲基转移酶进行基因敲除,确认spmNMT1、spmNMT2基因参与spiroindimicins的生物合成后修饰过程,spmMT1、spmMT2、spmMT3、spmMT4基因参与indimicins的生物合成后修饰过程。(2)spmNMT1蛋白催化的甲基化反应是负责合成spiroindimicins的关键步骤,其基因灭活突变株不能生产spiroindimicins,主要积累chromopyrrolic acid和indimicins。体外酶学研究表明SpmNMT1为不需要金属离子辅助的SAM依赖型氧甲基转移酶,负责TDs吡咯环上羧基侧链的甲基化,介导chromopyrrolic acid进入spiroindimicins合成途径。SpmNMT2蛋白具有两个结构域,分别为AdoMet_Mtases结构域和NADB_Rossmann结构域。spmNMT2基因敲除突变株不积累spiroindimicin B/D,而积累spiroindimicin A,indimicins和两个TDs同系物,证实SpmNMT2参与spiroindimicin B/D的生物合成后修饰,是催化合成5-5螺环结构的关键酶。通过体外酶学实验证实SpmNMT2的AdoMet_Mtases结构域能够催化spiroindimicin C甲基化生成spiroindimicin B,但NADB_Rossmann结构域的功能暂不确定。(3)通过基因大片段敲除实验证实spmMT1-4基因编码的4个甲基转移酶参与indimicins的生物合成后修饰过程,与spiroindimicins的生物合成无关。基因敲除和体外生化实验证明SpmMT1负责indimicins吡咯环上的碳甲基化。通过基因敲除实验推测SpmMT2负责吲哚环上的氮甲基化,SpmMT3和SpmMT4负责引起吲哚环芳香性被破坏的碳甲基化。从ΔspmMT4突变株中分离得到关键生物合成中间体化合物31,喂养实验表明化合物31能够转化生成终产物indimicin B/E,证实了我们对indimicins生物合成后修饰途径的推测。(4)最后,通过生物信息学分析,获得了实验室另一株spiroindimicin B生产菌SCSIO 11791中的TDs生物合成基因簇(slm),并通过基因组序列比对,初步定位了参与spiroindimicin A后修饰过程中5-6螺环形成的细胞色素P450基因。综上所述,本论文推导并证实了从chromopyrrolic acid到spiroindimicins和indimicins的生物合成后修饰过程,鉴定了参与后修饰过程的6个甲基转移酶基因,通过体内基因敲除和体外酶学实验对这些功能基因进行了验证。从突变株中分离鉴定了14个新的TDs类化合物,通过X-ray衍射和圆二色谱比对确定了部分化合物的绝对构型。另外,成功构建了spm基因簇在不同宿主中的表达体系,这些都为利用合成生物学改造、设计合成结构新颖的TDs提供了依据。
Document Type学位论文
Identifierhttp://ir.scsio.ac.cn/handle/344004/18001
Collection学位论文(博士)
Recommended Citation
GB/T 7714
马亮. 深海链霉菌Streptomyces sp. SCSIO 03032中色氨酸二聚体生物合成后修饰基因的鉴定和功能研究[D]. 南海海洋研究所,2018.
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