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马氏珠母贝胰岛素样系统基因的克隆及功能分析
Alternative TitleCloning and Functional Analysis of Genes of the Insulin-like System in Pearl Oyster, Pinctada fucata
张华
Thesis Advisor何毛贤
2018
Degree Grantor南海海洋研究所
Degree Name博士
Degree Discipline海洋生物学
Keyword马氏珠母贝,胰岛素样信号通路,PfILP,Pfigfbp
Abstract马氏珠母贝,又名合浦珠母贝,为生产海水珍珠的主要母贝,具很高的经济价值。胰岛素及其信号通路在动物细胞生命活动中发挥广泛且重要的调节作用,目前关于贝类胰岛素样信号通路的分子机理研究的较少,本论文对马氏珠母贝胰岛素样多肽及其信号通路相关基因进行克隆及功能分析,将有助于解析马氏珠母贝胰岛素样信号通路的调控机制和生物学作用。1. 通过RACE末端扩增,论文克隆到了马氏珠母贝胰岛素通路相关的Pfirs1、Pfpik3r1、Pfakt、Pfsos2、PfRap-1、PfRaf、Pferk七个基因,胰岛素样多肽基因(PfILP)和胰岛素样生长因子结合蛋白基因(Pfigfbp)。Pfirs1基因cDNA全长5388bp,开放阅读框3441bp, 编码1146个氨基酸;Pfpik3r1基因的cDNA全长为5458 bp,开放阅读框2829bp,编码942个氨基酸;Pfakt基因cDNA全长4021bp,开放阅读框1464bp,编码487个氨基酸;Pfsos2基因cDNA全长6984 bp,开放阅读框3807bp,编码1268个氨基酸;PfRap-1基因cDNA全长2156 bp,开放阅读框558,编码185个氨基酸;PfRaf基因cDNA全长3916,开放阅读框2112,编码703个氨基酸;Pferk cDNA全长1928 bp,开放阅读框1074 bp,编码357个氨基酸;PfILP cDNA序列全长1443 bp,开放阅读框513 bp,编码170个氨基酸,由四个外显子和三个内含子组成;Pfigfbp基因cDNA全长不包括poly(A)尾端共有1098 bp,开放阅读框为465 bp,编码154个氨基酸,由3个外显子和个内含子组成。同源比对和进化分析表明,这些基因都具有较保守的结构域,在进化上较保守,说明马氏珠母贝可能存在类似于高等动物的胰岛素通路系统。2. Realtime-PCR 实时荧光定量技术分析表明,Pfirs1、Pfpik3r1、Pfakt、Pfsos2、PfRap-1、PfRaf、Pferk七个基因在极体期、2-细胞期、32细胞期、囊胚期、担轮幼虫期、D-型期和外套膜、鳃、消化腺、性腺、闭壳肌、足、心脏中均广泛的表达。PfILP基因在检测的各发育时期和组织中都能表达,其中在2-细胞期的表达量最高,壳顶幼虫期表达量较低;在足组织中的相对表达量最高,在性腺组织中的表达最低。Pfigfbp在不同胚胎和幼虫发育时期均表达,其中在32-细胞时期表达量最高;Pfigfbp基因在各组织中也广泛表达,其中在足中的表达最高。说明这些基因可能具有较广泛的功能。3. 在体外原代培养的马氏珠母贝鳃细胞中,80nM外源激素IGF-I或者IGF-II在不同时间点可调控Pfirs1、Pfpik3r1、Pfakt、Pfsos2、PfRap-1、PfRaf、Pferk这七个胰岛素通路相关基因的不同表达。MAPK抑制剂PD98059能抑制Pfsos2、PfRap-1、PfRaf、Pferk基因的表达,PI3K抑制剂Wortmannin处理对Pfirs1、Pfpik3r1、Pfakt基因的mRNA表达没有显著影响。在体外原代培养的外套膜组织细胞中,20 nM IGF-I和10 nM IGF-II能显著增加PfILP mRNA表达。IGF-I和IGF-II刺激外套膜原代细胞,也能导致PfigfbpmRNA的表达变化。表明外源生长因子能调节马氏珠母贝胰岛素信号通路系统。4. 利用 pET-28a原核表达载体构建了含马氏珠母贝PfILP成熟肽的重组质粒,使用Transetta(DE3)成功表达了PfILP成熟肽蛋白;PfILP以包涵体蛋白形式存在,最佳培养条件为0.5 mM IPTG诱导,37 ℃ 连续培养10 h。经过包涵体蛋白的溶解、变性、复性,获得了有活性的重组蛋白PfILP。0.25 ~1.5 μg/ml PfILP能显著地促进外套膜原代细胞的活性,1μg/ml的PfILP能促进293T细胞周期G1至S期的进行。在不同浓度范围和时间点,PfILP能诱导外套膜原代细胞胰岛素受体基因Pfirr,以及其下游信号通路相关基因Pfirs1、Pfakt、Pfpik3r1、Pfraf、Pfsos2、Pferk、Pfigfbp在mRNA水平的表达;同时,能激活PfIRR蛋白的表达,引起PI3K信号通路AKT蛋白和MAPK信号通路p44/p42-MAPK蛋白的磷酸化表达。进一步分析表明,PfILP能诱导马氏珠母贝糖原合成相关基因GSK-3β、PP1和GK mRNA的表达,以及PP1蛋白的表达和GSK-3β蛋白的磷酸化。利用pMAL-c2X原核表达载体构建了含马氏珠母贝PfIGFBP成熟肽的重组质粒,使用Transetta(DE3)成功表达了马氏珠母贝PfIGFBP成熟肽蛋白。PfIGFBP重组蛋白能增强外套膜原代细胞的活性,但对Pfakt和Pferk基因表达水平无显著影免疫共沉淀实验表明PfILP能与PfIRR结合。这些结果证实PfILP能通过与PfIRR相互作用,然后调控其受体、下游信号分子的表达与磷酸化,从而参与细胞活性、糖原代谢等生理过程。
Document Type学位论文
Identifierhttp://ir.scsio.ac.cn/handle/344004/18002
Collection学位论文(博士)
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GB/T 7714
张华. 马氏珠母贝胰岛素样系统基因的克隆及功能分析[D]. 南海海洋研究所,2018.
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