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红树林来源的纤维素降解真菌的鉴定、混合发酵及内切纤维素酶的研究
Alternative TitleIdentification, mixed fermentation and endoglueanases analysis of cellulose degradation fungi from mangrove forests
曾思泉
Thesis Advisor董俊德
2018
Degree Grantor南海海洋研究所
Degree Name博士
Degree Discipline海洋生物学
Keyword红树林,真菌,纤维素酶,发酵
Abstract红树林以其独特的生态环境蕴藏着丰富的微生物资源,由于红树林中植物凋落物、有机碎屑含量非常巨大,因此大部分微生物具有降解木质纤维素的能力。目前关于三亚红树林中真菌的群落分布特征及其纤维素降解活性的研究较少,本文以海南三亚红树林根际土壤为研究对象,利用可培养的方法探究红树林中真菌的群落结构,分析可培养真菌的纤维素降解活性并对其进行菌种鉴定,同时以纯培养真菌总RNA为模板,扩增其内切纤维素酶基因片段,构建毕赤酵母表达体系,探究纤维素酶的活性特征。本研究不仅有助于阐明我国三亚红树林区域真菌的分布,还对真菌纤维素酶的研究提供了重要的参考和借鉴。本文的主要研究结果如下:(1)通过对红树林根际土壤真菌的筛选,共获得两百多株可培养真菌。这些真菌可分为33属,175种。以子囊菌纲(Ascomycetes)真菌为主,其中青霉属(Penicillium)和曲霉属(Aspergillus)为优势属,分别占全部分离真菌的25.7%和26.3%,其次为枝孢属(Gladaxporism)和踝节菌属(Talaromyces)。有138种真菌具有纤维素降解活性,占全部分离可培养真菌的79%,水解圈外径/内径比例为1.03~6.00。绝大多数真菌均可产生孢子,在28 ℃培养3~5 d后,菌落直径均可达到30 mm左右。(2)通过分子生物学和形态学鉴定,我们获得一株枝孢属真菌疑似新种。该菌株具有典型的枝孢属真菌的形态特征,且与近缘菌株的ITS、BT和CMD序列的相似性较低,分别仅有96%、86%和89%。该菌株具有纤维素降解活性,摇床培养3 d后发酵液中纤维素酶活性最高,达到23.46 U/mL,同时所产纤维素酶的最适pH 和最适反应温度分别为5.0和50 ℃。(3)选取5株高活性曲霉属纤维素降解真菌做混合培养研究。这些真菌均能产生完整的纤维素酶系,摇床培养第3 d时发酵液中纤维素酶活性最高,其中纤维素酶各组分活性在各菌株中的高低均为:Cx > C1 > β-Gase > FPA,菌株在pH 3.0和35 ℃的条件下发酵所产纤维素酶活性最高。在最适发酵条件下,混合培养的真菌发酵液纤维素酶活性比纯培养真菌要高,平均高出11%~26%左右。原因可能是混合培养的真菌分泌多种纤维素酶,协同作用组成高效完整的纤维素酶系,比纯培养真菌所产生的纤维素酶系更加有效。(4)利用逆转录技术,从曲霉属真菌(Aspergillus versicolor)SCSIO 43523中扩增得到内切纤维素酶基因EG 43523,该基因全长1191 bp共由397个氨基酸组成,蛋白分子量约为43.2 kDa。利用毕赤酵母表达系统构建该基因的内切纤维素酶表达体系,在诱导表达第四天时酶活性最高为,达到32.12 U/mL,随后酶活性逐渐降低。原始菌株发酵上清液内切纤维素酶活性最高为42 U/mL左右,重组子发酵液酶活性低于原始菌株,原因可能是原始菌株能够分泌出完整的纤维素酶系,各组份之间协同作用降解羧甲基纤维素钠,因此其降解速率要高于内切纤维素酶单一组分。
Document Type学位论文
Identifierhttp://ir.scsio.ac.cn/handle/344004/18003
Collection学位论文(博士)
Recommended Citation
GB/T 7714
曾思泉. 红树林来源的纤维素降解真菌的鉴定、混合发酵及内切纤维素酶的研究[D]. 南海海洋研究所,2018.
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