SCSIO OpenIR  > 学位论文(博士)
Cytorhodin的生物合成研究
Alternative TitleInvestigation of the Cytorhodin Biosynthesis
桂春
Thesis Advisor鞠建华
2018
Degree Grantor南海海洋研究所
Degree Name博士
Degree Discipline海洋生物学
Keywordcytorhodin,糖基转移酶,还原性脱糖反应,FAD依赖氧化酶,组合生物学
Abstract本研究重点聚焦一株海洋来源替达霉素生产菌Streptomyces sp. SCSIO 1666。该菌株分离自南海北部沉积物,其粗提物具有很强的细胞毒活性。本论文通过传统化学分离手段结合组合生物学技术,充分挖掘其潜力活性分子并阐明其生物合成机制。本研究首先解析了未知功能蛋白TrdC在替达霉素生物合成中的功能。TrdC,SlgL,LipX2,KirHI和FacHI属于一类高度同源但功能未知的蛋白,可能分别参与tirandamycin B,streptolydigin,a-lipomycin,kirromycin和factumycin的生物合成,但其具体功能尚不明确。通过基因敲除实验、回补实验和模拟底物体外酶学实验、点突变实验以及系统发育树分析,我们阐明了该类蛋白是一类新型的Dieckmann环化酶,能够催化2,4-二酮吡咯烷和吡啶环的形成。通过构建替达霉素缺失突变株Streptomyces sp. SCSIO1666/ΔtrdA1DH,从中分离鉴定了一类蒽环糖苷类抗生素cytorhodins X和Y,cosmomycins A和B以及irremycin,同时鉴定了其生物合成基因簇。负责该类化合物生物合成基因簇cyt全长约58 kb,包括51个开放阅读框,由5个聚酮碳骨架合成相关的基因cytE和cyt1-4,3个糖基转移酶基因cytG1,cytG2和cytG3,2个辅助糖基转移酶的基因cytW和cytL,26个编码与蒽环母核形成、氧化还原酶及糖基修饰酶等相关的基因cytA-D、cytF-K、cytM、cytN-S、cytS1-S6、cytU、cytV和cytX,9个编码与调节抗性相关的基因cytR1-R4和cytT1-T5,以及1个未知功能基因cytY构成。Cytorhodins X(1)和Y(2)具有罕见的C-9位糖基化结构。通过基因敲除和喂养实验,研究了三个糖基后修饰基因cytG1,cytG2和cytG3,两个辅助糖基转移酶的基因cytW和cytL在cytorhodin生物合成中的功能。结果表明,CytG1/CytL负责C-7位l-rhodosamine的加载,CytG3/CytW作为一个迭代型糖基转移酶复合物同时负责C-9/C-10位l-rhodosamine的加载。CytG2则同时负责C-7和C-10位三糖链结构中第二个和第三个糖基的加载。终产物1和2,cosmomycins A(3)和B(4)以及irremycin(5)中C-7位脱氧结构的生物合成机制目前尚不明确。通过基因敲除、体外酶学实验研究了硝基还原酶CytA、醛酮还原酶CytC和鸟氨酸环化脱氨酶CytU在cytorhodin生物合成中的功能。实验结果表明,CytA在无氧条件下能够催化C-7位三糖链底物的还原性消除,C-7-OH底物未能观察到反应;CytC在有氧条件下能够高效催化三糖链底物还原性消除反应,同时能够催化C-7-OH底物反应;CytU在有氧条件下能够同时高效催化糖基化底物和羟基化底物。Cosmomycin类化合物三糖链中末端糖中存在差异,推测这种差异是由氧化还原后修饰途径导致的。通过体内基因敲除实验,我们获得了积累末端糖为l-rhodinose的中间体。体外酶学实验表明,氧化酶CytB连续催化含有末端糖l-rhodinose中间体形成含有cinerulose B的终产物。为进一步发掘新的蒽环类化合物,我们利用组合生物学构建了重组菌株Streptomyces sp. SCSIO 1666/17C4。该菌株整合了利迪链霉素来源的包含l-rhodinose生物合成基因及糖基转移酶基因。我们从重组菌株中分离获得了13个新的C7-O-蒽环类化合物。抗肿瘤活性测试结果表明化合物7-4和7-13对人类结直肠癌细胞株HCT-116具有很好的抑制活性,其IC50值分别为0.3 和0.2 μM,与阳性对照表柔比星活性相当。综上所述,本研究发现了一类新型Dieckmann环化酶,鉴定了cytorhodin生物合成基因簇,阐明了部分基因在cytorhodin生物合成中的功能,同时通过组合生物学获取新的衍生物,其结果为揭示cytorhodin完整的生物合成机制奠定了基础。
Document Type学位论文
Identifierhttp://ir.scsio.ac.cn/handle/344004/18007
Collection学位论文(博士)
Recommended Citation
GB/T 7714
桂春. Cytorhodin的生物合成研究[D]. 南海海洋研究所,2018.
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