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Fluostatin二聚体的形成机制和生物合成后修饰基因的功能研究
Alternative TitleInvestigation on the Dimer Formation Mechanism and Functions of Tailoring Modification Genes in Fluostatin Biosynthesis
黄春帅
Thesis Advisor张长生,张文军
2018
Degree Grantor南海海洋研究所
Degree Name博士
Degree Discipline海洋生物学
Keyword异源表达,Fluostatin二聚体,对醌酮甲基化物,生物合成,突变株
AbstractMicromonospora rosaria SCSIO N160是从南海30米深的海底沉积物中分离得到的蔷薇小单孢菌,可以生产丰富的fluostatins(FSTs)类化合物。FSTs是一类包含有独特的苯并芴6?5?6?6四环骨架结构的非典型角环素芳香聚酮类化合物。迄今为止仅发现21个该类型化合物,包括:FSTs A?Q、prefluostatin、pyrazolofluostatins A?C和C-C二聚体difluostatin A,显示出不同程度的抗菌、抗肿瘤和二肽酶抑制等活性。本论文的主要成果:通过异源表达FST生物合成基因簇分离鉴定了结构多样化的FST结构类似物,发现了FST的II型聚酮合酶至少可以介导5种不同的环化反应;揭示了酰基FST经非酶催化的脱酰基反应形成二聚体的反应机理并应用于构建新的二聚产物;通过对5个氧化酶基因和1个与重氮合成相关基因缺失双交换突变株的产物分离鉴定,初步推测了这六个酶在FST生物合成途径中的功能。FST生物合成基因簇的表达产物分离鉴定:前期工作中,FSTs来源于II型聚酮合酶的生物合成基因簇获得了克隆和鉴定,并在Streptomyces coelicolor YF11中得到了异源表达,产生了新的异源二聚体difluostatin A。为了寻找更多具有良好生物活性的新颖FSTs类化合物,我们将全长约40 kb的FSTs生物合成基因簇fls分别在其它三种模式宿主Streptomyces lividans TK64、Streptomyces albus J1074和Streptomyces pactum SCSIO 02999 XM47i中进行异源表达。表达结果显示每个宿主有不同的代谢图谱,而重组菌株S. albus J1074/pCSG5033中的FSTs类化合物最为丰富。对重组菌株S. albus J1074/pCSG5033进行了40升规模的发酵培养。随后,利用各种色谱方法进行分离纯化,从该菌株中共分离鉴定29个化合物,包括25个由II型聚酮合酶合成的芳香聚酮类化合物以及4个其它类型化合物。其中9个为新的芳香聚酮化合物(isoprefluostatin、FST R、FST S、difluostatins B–D、SEK43F、trifluostatin A和fluoquinone,1?9),1个为新的异吲哚类化合物(1-methyl-5-methylamideisoindole-4,7-dione,10)和一个首次从天然产物中获得的化合物dipyrrolylmethene(27)。Difluostatins B–D为三个新颖的异源二聚体,其中difluostatin B是通过一个稀有的吗啡啉样六元环连接两个FSTs单体,difluostatins C和D是通过吡喃环样六元环把FST单体与SEK43片段连接起来。Trifluostatin A是一个含有与difluostatins C和D相同的吡喃环样六元环的罕见异源三聚体。FST S是FST单体与对氨基苯甲酸通过C?N键连接的,而SEK43F则是SEK43片段与吡咯甲醛通过酶催化或自发羟醛缩合形成的新骨架。我们推测SEK43F是由宿主S. albus J1074和异源基因簇fls之间互作形成的。遗憾的是,这些化合物对供试菌或细胞株没有表现出显著抑菌和抗肿瘤等生物活性。FST的II型聚酮合酶介导的环化反应:经推测,所分离鉴定的芳香聚酮类化合物可能由II型聚酮合酶介导的5种不同的环化方式形成。值得注意的是,fluoquinone的环化方式很特别,其第一个芳香环的形成是通过常见于真菌中的F-模型环化而来,这种环化模式在细菌的II型聚酮合酶中十分罕见。FST二聚体的形成机制:进一步实验表明,结构多样的C?C或C?N耦联的FST二聚体并不是真正的次级代谢产物,而是由含有酰基的FSTs(acyl FSTs)经非酶催化的脱酰基反应自发形成的。我们深入研究了其反应机理,发现acyl FSTs可以自发脱酰氧基形成对醌酮甲基化物中间体,再通过1,6-亲核加成形成各种各样C?C或C?N耦联的同源或异源FSTs类二聚体。含酰基FSTs类化合物这种不同寻常的特性的揭示,不仅阐明了非典型角环素的二聚化是如何发生的,而且可以用于组装不同的C?C或C?N偶联的芳香聚酮二聚体,甚至可以用于创制杂合抗生素。有意思的是,我们还发现水解酶FlsH能够有效地催化acyl FSTs的脱酰反应,从而阻止在体内积累acyl FSTs,以防其自发转化为可能会有细胞毒性的有毒对醌酮甲基化物中间体。基因缺失突变株的产物分离鉴定:为了阐明FST生物合成基因簇中的一系列编码氧化酶的基因和与重氮合成相关基因的生物学功能,我们利用双交换基因敲除的方法分别构建了5个氧化酶基因和1个与重氮合成相关基因缺失的突变株,ΔflsO2(聚酮氧化酶)、ΔflsO4(聚酮氧化酶)、ΔflsO5(聚酮氧化酶)、ΔflsP(FAD结合的氧化还原酶)、ΔflsO1(聚酮氧化酶)和ΔflsN3(氨基转移酶)。我们从ΔflsO2突变株中分离鉴定一个重要中间体prejadomycin,通过体外酶活性实验,阐明了FlsO2为双功能氧化酶,能够将prejadomycin转化为dehydrorabelomycin;从ΔflsO4和ΔflsO5突变株中分离鉴定9个已知化合物;从ΔflsP突变株中鉴定12个化合物,包括6个新化合物48–53,其中化合物48的绝对构型通过X-ray单晶衍射确定;从ΔflsO1突变株中鉴定7个化合物,包括3个新化合物54–56;从ΔflsN3突变株中鉴定11个化合物,包括5个新化合物57–61,其中57/57′的结构通过X-ray单晶衍射确定。根据以上研究我们推测这些基因可能负责FSTs骨架的形成、A环的高度氧化或跟氮原子的引入有关。本文分离鉴定多个假定的FSTs生物合成中间体,为体外酶活研究和生物合成途径推导提供了充足的底物保障。本课题的研究对充分开发小单孢菌M. rosaria SCSIO N160的生物合成潜能,发现更多活性化合物资源,深入揭示FSTs生物合成中的新机制及发现新功能酶具有重要的指导意义。
Document Type学位论文
Identifierhttp://ir.scsio.ac.cn/handle/344004/18008
Collection学位论文(博士)
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GB/T 7714
黄春帅. Fluostatin二聚体的形成机制和生物合成后修饰基因的功能研究[D]. 南海海洋研究所,2018.
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