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石斑鱼MicroRNAs在虹彩病毒SGIV和神经坏死症病毒RGNNV感染过程中的免疫调节作用
Alternative TitleImmune regulation effects of grouper MicroRNAs during SGIV and RGNNV infection
尼松伟
Thesis Advisor秦启伟,王晓雪
2018
Degree Grantor南海海洋研究所
Degree Name博士
Degree Discipline海洋生物学
KeywordmiRNA,石斑鱼,先天免疫,病毒
AbstractMicroRNA(miRNA)是一类长度约为22 nt的内源性非编码RNA序列,它可以通过碱基互补的方式与靶基因信使RNA(mRNA)分子结合,诱导mRNA分子的降解或使其翻译过程受阻,从而在转录后水平发挥调节基因表达的功能。在本实验室前期的工作中,已经对我国以及东南亚地区重要的海水养殖鱼类—石斑鱼编码的miRNA进行了序列鉴定,并对病毒感染前后石斑鱼miRNA的差异表达情况进行了检测。在此基础上,本文选择石斑鱼编码的miR-146a以及miR-181(包括miR-181a和miR-181b),在细胞水平研究了其对石斑鱼虹彩病毒SGIV(Singapore grouper iridovirus)和神经坏死症病毒RGNNV(Red-spotted grouper nervous necrosis virus)感染的影响,并从分子免疫学的角度探究了miRNA在石斑鱼抗病毒免疫调控网络中的作用机制,取得了以下研究成果:1. 阐明了miR-146a通过抑制病毒SGIV诱导的细胞凋亡以及胞内NF-?B信号活性,从而促进了病毒在细胞内的增殖。本研究发现,miR-146a在不同物种中具有很高的序列相似性,在斑马鱼、鲤鱼以及石斑鱼中更是具有完全相同的核苷酸序列,表明其具有高度的进化保守性。利用由病毒SGIV和细胞FHM(Fathead monnow)组成的感染模型,证实了高水平的miR-146a可以促进病毒SGIV基因的转录以及子代病毒的产生,而人为降低胞内miR-146a的表达水平则会产生抑制病毒感染的效果。进一步的研究发现,miR-146a会抑制病毒SGIV诱导的细胞凋亡,维持病毒生存和复制的细胞空间,同时抑制胞内NF-?B启动子活性,抑制NF-?B介导的细胞免疫反应,最终帮助病毒实现增殖的最大化。2. 证实了miR-146a可以通过靶向石斑鱼TRAF6(Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6)基因,抑制TRAF6介导的细胞免疫反应,进而促进神经坏死症病毒RGNNV的感染。在神经坏死症病毒RGNNV对石斑鱼细胞的感染过程中,也发现了高水平的miR-146a促进病毒基因转录的现象。随后,利用miRNA靶基因预测软件进行分析,发现石斑鱼免疫关键基因TRAF6 mRNA的3’非翻译区(Untranslated region,UTR)存在miR-146a的潜在靶点。进一步利用pMIR-REPORT荧光素酶报告基因系统,发现miR-146a确实可以特异性地结合该靶点并抑制基因的表达,即证实了石斑鱼miR-146a是通过抑制TRAF6介导的免疫反应,从而促进了病毒RGNNV的感染。3. 克隆了石斑鱼miR-181的预测靶基因,核受体共抑制因子辅因子EcTBLR1(Transducin β-like 1 X-linked receptor 1),并系统研究了其在病毒感染过程中对基因转录活性的调控机制。EcTBLR1蛋白编码框(Open reading frame,ORF)全长为1548 bp,编码515个氨基酸,其与大黄鱼以及人类TBLR1同源相似性高达99%和95%。在病毒SGIV或RGNNV感染以后,EcTBLR1均出现了蛋白表达水平降低,以及定位从细胞质向细胞核移动的现象;同时,其对细胞AP1,NF-?B以及IFN启动子活性的抑制作用也发生明显减弱甚至消失。随后,利用siRNA对EcTBLR1进行功能缺失之后,发现低水平EcTBLR1条件下病毒SGIV和RGNNV的感染都受到了抑制。依据这些结果我们推测,EcTBLR1在静息状态下负责胞内免疫反应的抑制,而在病毒感染时则可能参与了细胞核内免疫信号的转录激活过程。4. 对石斑鱼编码的miR-181分别在两种病毒SGIV和RGNNV感染过程中的功能进行了初步的探索,证实了其对病毒SGIV的感染具有抑制作用,并验证了其对EcTBLR1的靶向抑制作用。在对石斑鱼miR-181,包括miR-181a和miR-181b进行的初步研究中,我们发现病毒SGIV和RGNNV的的感染都可以上调miR-181的表达,而高水平的miR-181会抑制病毒SGIV基因的转录以及子代病毒的产生。随后,依据miRNA靶基因预测分析结果,通过Westernblot实验证实了miR-181可以靶向抑制石斑鱼EcTBLR1蛋白的表达,表明该基因是石斑鱼miR-181的一个靶基因。为了更深入地探究EcTBLR1在石斑鱼基因转录调控中的作用机制,以及miR-181靶向EcTBLR1与抑制病毒感染之间的联系,本研究还首次尝试在石斑鱼细胞中开展基于CRISPR-Cas9的基因编辑技术,并成功构建了5个针对EcTBLR1的基因敲除质粒,期望能从EcTBLR1完全敲除的角度,进一步补充和完善上述实验结果。
Document Type学位论文
Identifierhttp://ir.scsio.ac.cn/handle/344004/18015
Collection学位论文(博士)
Recommended Citation
GB/T 7714
尼松伟. 石斑鱼MicroRNAs在虹彩病毒SGIV和神经坏死症病毒RGNNV感染过程中的免疫调节作用[D]. 南海海洋研究所,2018.
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