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海洋放线菌Streptomyces costaricanus SCSIO ZS0073中制霉色基素和放线菌素D生物合成基因簇的鉴定与功能分析
Alternative TitleIdentification and functional analysis of the biosynthetic gene cluster of fungichromin and actinomycin D from the sea-drived actinomycete Streptomyces costaricanus SCSIO ZS0073
贾艳玺
Thesis Advisor鞠建华
2018
Degree Grantor南海海洋研究所
Degree Name硕士
Degree Discipline海洋生物学
Keyword制霉色基素,放线菌素D,生物合成基因簇,海洋放线菌
AbstractStreptomyces costaricanus SCSIO ZS0073是分离自我国广西红沙公园泥样的一株海洋放线菌。通过发酵培养,发现该菌株能够生产制霉色基素 (fungichromin)和放线菌素D (actinomycin D) 两类次级代谢产物。Fungichromin是一类大环内酯抗生素,其骨架为含有共轭五烯的二十九元多烯大环内酯结构。Fungichromin具有显著的抗纹枯病菌、水稻菌核病菌、稻瘟病菌和稻曲病菌活性,因此在农业作物抗病虫害防治中具有良好的应用前景。Actinomycin D属于色素肽内酯类抗生素,其骨架为两个环五肽对称连接在吩噁嗪酮环上的结构,因具有良好的抗肿瘤活性而用于肾母细胞瘤、绒毛膜上皮癌、横纹肌肉瘤和神经母细胞瘤的临床治疗。这两类天然产物具有良好的开发应用价值,而其相关生物合成研究方兴未艾。因此本研究选取 S. costaricanus SCSIO ZS0073菌株,对fungichromin和actinomycin D的生物合成基因簇进行鉴定和功能分析,以期全面了解这两类化合物生物合成过程。现已取得了以下研究成果:1. S. costaricanus SCSIO ZS0073全基因组信息分析:通过对S. costaricanus SCSIO ZS0073进行全基因组扫描测序,获取该了菌株全基因组序列信息。测序结果显示:S. costaricanus SCSIO ZS0073基因组含有1个线性染色体和1个环形质粒。线性染色体长为8,610,980 bp;质粒长约32.1 kb。AntiSMASH(4.0.0版本)基因组注释预测显示共含有36个生物合成基因簇,包括4个非核糖体肽合成酶(Non-ribosomal peptide synthetases/NRPS)基因簇,5个萜烯合成酶(Terpene)基因簇,2个Bacteriocin合成酶基因簇,11个杂合基因簇。2. S. costaricanus SCSIO ZS0073中fungichromin生物合成基因簇的鉴定与分析:基于S. costaricanus SCSIO ZS0073全基因组序列信息,再结合fungichromin的结构特点进行生物信息学分析,我们确定一个长约96.1 kb含32个开放阅读框 (Open reading frame/ORF) 的I型PKS (Polyketide synthase)生物合成基因簇。通过对该基因簇内的基因进行功能注释发现其含有5个PKS编码基因 fgmJ1- fgmJ5;5个调控蛋白编码基因 fgmB, fgmL, fgmM, fgmP, fgmS。5个后修饰蛋白编码基因fgmG1-fgmG2, fgmH1-fgmH3,1个转运蛋白编码基因 fgmA。为鉴定该基因簇,本研究利用PCR-targeting介导的基因失活技术,对选定的PKS基因fgmJ1进行了插入失活,成功构建其双交换突变株。结合发酵分析结果,该突变株不再生产目标产物,确定该基因为 fungichromin生物合成基因。结合PKS生物合成过程及fungichromin结构特点推测了fungichromin骨架结构完整的生物合成途径。最后由两个后修饰基因(Cytochrome P450) fgmH1, fgmH2负责完成fungichromin骨架结构上C3位和C15位的羟基化而生成最终产物。3. S. costaricanus SCSIO ZS0073中actinomycin D生物合成基因簇的鉴定与功能分析:基于同一菌株全基因组序列信息我们定位了长约70 kb,含43个ORF的actinomycin D生物合成基因簇。通过对该基因簇内的基因进行功能注释发现其含有2个非核糖体肽合成酶编码基因acnM2, acnM3;8个吩噁嗪酮生物合成基因acnL1-acnL8;9个未知蛋白编码基因acnE, G, H, J, K, M1等;2个调控蛋白编码基因acnF, acnO和3个转运调控蛋白编码基因acnQ, R, S等。为确定actinomycin D基因簇中各个基因的功能,我们对actinomycin D生物合成基因簇中的24个功能基因进行了敲除阻断,成功构建其双交换突变株。通过发酵培养并结合HPLC检测分析,初步推导:acnM3, acnM1为骨架生物合成基因;acnL1-acnL8为吩噁嗪酮前体生物合成基因;acnE, acnF为生物合成负调控基因;acnQ, acnR为转运调控编码基因;acnN为生物合成正调控基因;acnK对actinomycin D生物合成具有重要作用;acnG, acnH对actinomycin D生物合成无影响;同时验证了其他生物合成基因的功能。本研究鉴定了两个高产负调控基因acnE, acnF和两个转运调控编码基因acnQ, acnR。这些研究结果为后续深入研究其代谢调控与生物合成催化机理提供了良好的借鉴与参考,同时为发掘新颖的结构类似物和代谢中间产物及构建工程菌株打下了扎实的物质基础。
Document Type学位论文
Identifierhttp://ir.scsio.ac.cn/handle/344004/18028
Collection学位论文(硕士)
Recommended Citation
GB/T 7714
贾艳玺. 海洋放线菌Streptomyces costaricanus SCSIO ZS0073中制霉色基素和放线菌素D生物合成基因簇的鉴定与功能分析[D]. 南海海洋研究所,2018.
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