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内源质粒上VagCD和ParDE毒素-抗毒素系统的功能研究
Alternative TitleIdentification and Characterization of Plasmid-born VagCD and ParDE Toxin-Antitoxin Systems
赵玄玉
Thesis Advisor王晓雪
2018
Degree Grantor南海海洋研究所
Degree Name硕士
Degree Discipline海洋生物学
Keyword质粒,毒素-抗毒素系统,VagCD,ParDE,生物被膜
Abstract毒素-抗毒素系统在原核生物中分布十分广泛,在细菌的生命活动中扮演了重要的角色,如维持水平转移元件的稳定性或帮助细菌应对环境胁迫等。许多环境菌株的质粒上都携带多对毒素-抗毒素系统,但目前对它们的生理功能研究仍较少。本文以水体环境来源的希瓦氏MR-1(Shewanella oneidensis)和环境中的大肠杆菌(Escherichia coli)和为研究对象,结合分子和遗传生物学方法,初步研究其内源质粒上的四对毒素-抗毒素系统的生理功能,包括希瓦氏 MR-1中的一对ParDE毒素-抗毒素系统(SO_A0088-A0087)以及大肠杆菌中的三对VagCD毒素-抗毒素系统。主要取得了以下研究成果:1. 实验鉴定希瓦氏MR-1内源性大质粒上的一对ParDE家族II型毒素-抗毒素系统SO_A0088-A0087。毒素SO_A0088在大肠杆菌以及其原宿主希瓦氏MR-1内均具有明显的细胞毒性,并导致细胞分裂存在缺陷。抗毒素SO_A0087能够完全拮抗毒素的毒性;同时, EMSA证实抗毒素SO_A0087能够结合自身的启动子。另外,本文还通过易错突变的方法找到了毒素SO_A0088的三个毒性关键位点。2. 对124株菌株进行菌种鉴定,通过二代测序分析发现,其中23.4%的菌株都携带了VagCD毒素-抗毒素系统,而且绝大多数分布在质粒上。对现有的6株质粒上携带VagCD并已全基因组测序的大肠杆菌分析发现根据核苷酸序列是否完全一致可将VagCD分为三组:VagC1D1、VagC2D2和VagC3D3。结合表型差异,选取14EC017、14EC020、14EC033-r三株菌为主要研究对象。通过对三组VagCD进行鉴定发现可分为两种形式,对这两种形式的主要研究结果如下:1)两组分VagCD系统(VagC1D1和 VagC3D3):实验证实它们为典型的 Ⅱ 型毒素-抗毒素系统,发现表达毒素时均会使细胞变得肿胀(“swollen” cell),定点突变证实靠近毒素N端的两个保守酸性氨基酸是毒素的活性位点;利用纯化的毒素蛋白VagD1,证实其具有切割mRNA的核糖核酸内切酶活性。通过体外凝胶电泳迁移实验(EMSA),证实抗毒素VagC1和合体VagC1D1可与自身启动子结合。成功地实现了VagC3D3在原宿主14EC033-r的敲除,但目前还未找到敲除株与野生株的表型差异。2)AbrB-VagC2D2三组分系统:鉴定VagC2D2时发现,克隆合体的重组菌株显露出毒性,为非典型的毒素-抗毒素系统。随后在vagC2上游预测出一个小基因abrB,实验证实其可与毒素VagD2发生蛋白-蛋白相互作用,帮助中和毒素毒性。定点突变证实靠近毒素N端的两个保守酸性氨基酸是VagD2的活性位点。通过EMSA和体内β-半乳糖苷酶活性实验,证实抗毒素VagC2及合体VagC2D2可与自身启动子结合,抑制其转录。实验证实AbrB-VagC2D2的敲除影响了14EC020的群集运动(swarming),降低其固液生物被膜的形成能力。扫描电镜观察发现处于浮游状态稳定期的敲除株鞭毛明显少于野生株,同时结合qRT-PCR实验发现敲除株中鞭毛基因簇中合成和调控关键基因的表达下调2~4倍。转录组测序分析发现AbrB-VagC2D2的敲除影响了氨基酸和糖代谢相关通路基因的表达。目前对于质粒上毒素-抗毒素系统生理功能的认知主要停留在维持质粒的稳定性上,本论文首次发现广泛存在于肠杆菌质粒上的VagCD对细菌运动性及生物被膜形成能力的影响,具有一定的创新性。另外还初步鉴定了以三组分形式存在的VagCD家族的毒素-抗毒素系统AbrB-VagC2D2,为该家族的首例,为研究不同进化形式的毒素-抗毒素系统打下了基础。
Document Type学位论文
Identifierhttp://ir.scsio.ac.cn/handle/344004/18063
Collection学位论文(硕士)
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GB/T 7714
赵玄玉. 内源质粒上VagCD和ParDE毒素-抗毒素系统的功能研究[D]. 南海海洋研究所,2018.
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