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海洋链霉菌来源放线菌素D生物合成途径中7个基因的功能研究
Alternative TitleFunction Study of 7 Genes in Actinomycin D Biosynthetic Pathway from Marine-derived Actinomycetes
刘梦婵
Thesis Advisor鞠建华
2019夏季
Degree Grantor南海海洋研究所
Degree Name硕士
Degree Discipline海洋生物学
Keyword红树林来源微生物,放线菌素D,双脱甲基放线菌素,色氨酸2, 3-双氧化酶,犬尿氨酸酶
Abstract前期,本实验室人员于一株红树林来源的放线菌Streptomyces costaricanus ZS0073代谢产物中分离得到活性代谢产物放线菌素D。据报道,放线菌素D具有显著的抗菌,抗肿瘤以及抗病毒等生物活性,并且曾被用于临床治疗多种肿瘤,如黑色素瘤,Wilms瘤(肾胚细胞瘤),恶性内皮细胞性骨髓病和软组织肉瘤,但由于其对人体的肝肾毒性较大,限制了其在临床上的使用。因此对放线菌素的生物合成机制进行研究,并开发高效低毒的新型放线菌素有着十分深远及重要意义。为此,本论文围绕放线菌素D的生物合成取得了以下成绩:1、利用PCR-targeting介导的基因失活手段对放线菌素D生物合成基因簇中的7个基因进行了敲除,成功构建了基因的双交换突变株,通过发酵分析以及HPLC检测,我们发现当acnW,acnR失活时,放线菌素D产量明显降低;当敲除acnM时,突变株会产生新的代谢产物;敲除acnN2时,突变株丧失了放线菌素D生产能力;敲除细胞色素P450编码基因acnP时,发现突变株不再生产放线菌素X??;敲除acnQ和phs后,发现这两个基因对S. costaricanus ZS0073代谢产物并无影响。基于以上研究结果,我们初步确定了acnW,acnR为正调控基因,acnM为甲基转移酶基因,acnN2为非核糖体肽合酶编码基因,acnP为细胞色素P450编码基因,而acnQ和phs对放线菌素D的生物合成无影响。2、从甲基转移酶编码基因acnM突变株ZS0073/?acnM中首次分离得到了两个双脱甲基放线菌素(双脱甲基放线菌素D和双脱甲基放线菌素X2)。经结构鉴定,发现双脱甲基放线菌素X2为新化合物。对双脱甲基放线菌素D(1)进行抗菌和细胞毒活性检测,发现其对13株金黄色葡萄球菌具有良好的抑制活性(MIC在4~32 ug/mL);对藤黄微球菌的MIC在2 ug/mL;对枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的MIC在4 ug/mL。双脱甲基放线菌素D还对人急性T淋巴细胞白血病细胞(Jurkat)具有一定的抑制活性,其IC50为280.4 nM,与放线菌素D相比,双脱甲基放线菌素D对正常人体细胞的毒性降低了30倍之多。3、表达纯化了放线菌素D生物合成途径中的2,3-双氧化酶AcnH和犬尿氨酸酶AcnL。通过构建acnH和acnL在大肠杆菌E.coli BL21 (DE3)的异源重组表达菌株,在体外表达并纯化了AcnH和AcnL蛋白。体外酶催化反应结果表明,在37℃反应条件下,AcnH能够在血红素(Hemin)的参与下氧化色氨酸的形成N-甲酰犬尿氨酸。而AcnL能够在磷酸吡哆醛(PLP)的参与下催化3-羟基犬尿氨酸形成3-羟基邻氨基苯甲酸。以上工作为阐明放线菌素D的生物合成机制及其改造奠定了理论基础,同时也实现了利用体内功能基因失活等技术得到的双脱甲基放线菌素D,在对人体正常细胞减毒的基础上,对许多耐药的金黄色葡萄球菌都具有良好的抑制活性,具有开发成临床抗感染药物的潜力。
Document Type学位论文
Identifierhttp://ir.scsio.ac.cn/handle/344004/18093
Collection学位论文(硕士)
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GB/T 7714
刘梦婵. 海洋链霉菌来源放线菌素D生物合成途径中7个基因的功能研究[D]. 南海海洋研究所,2019.
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