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海洋真菌细菌共生体F190/B001代谢产物及Aborycin生物合成研究
Alternative TitleInvestigation on Metabolite from Marine Fungus-endobacterium Symbiont F190/B001 and Biosynthesis of Aborycin
邵明伟
Thesis Advisor鞠建华
2019
Degree Grantor南海海洋研究所
Degree Name博士
Degree Discipline海洋生物学
Keyword海洋微生物,真菌-细菌共生体,抗感染化合物,Aborycin,异源表达
Abstract微生物之间的共培养以及共生,可以激活一些处于沉默状态的生物合成基因簇或者共同影响一种化合物的生物合成,形成生物活性更强的活性分子。海洋微生物由于不同于陆生微生物的自然生境,其代谢途径多具有独特性,这些分子以及独特的代谢机制是新型活性物质的重要来源。本论文以南海北部海底淤泥微生物Spiromastix sp. SCSIO F190为研究对象,结合形态学观察以及分子生物学技术对菌株进行鉴定,并利用多种色谱分离技术(硅胶柱层析、LH-20葡聚糖凝胶柱层析、中压反相,高效液相等)对代谢产物进行分离纯化。同时综合运用1H-NMR,13C-NMR,HMQC,COSY,HMBC,X-ray,CD以及ESI-MS等多种波谱技术对其代谢产物进行结构鉴定。共分离鉴定了spiromarmycin等3个新化合物。利用计算化学的方法推测了化合物spiromarmycin(1)的互变机制,利用同位素喂养以及米曲霉Aspergillus oryzae NSAR1异源表达的方法初步研究了spiromarmycin(1)生物合成途径,并得到一个苯乙酸类衍生物的中间体(3)。生物活性测试结果表明新化合物1具有较好的抗细菌、抗白念、抗植物致病真菌以及辣椒疫霉的作用。此外利用酸水解以及二级质谱分析等手段鉴定了海洋放线菌Streptomyces sp. SCSIO ZS0098代谢产物I型lasso肽化合物aborycin(4);利用异源表达的方法鉴定了该化合物的生物合成基因簇。具体结果如下:1、利用形态学观察、PCR验证、绿色荧光染料染色、荧光原位杂交(FISH)以及绿色荧光蛋白(GFP)标记真菌内生细菌,激光共聚焦显微镜追踪其生活轨迹等方法证明细菌Alcaligenes faecalis SCSIO B001存活在新种真菌Spiromastix sp. SCSIO F190菌丝内部或者表面。Spiromastix sp. SCSIO F190以菌丝内部断裂的形式,形成节孢子,节孢子呈圆柱形,白色,壁光滑,表面有一层膜包裹,菌丝体上会有细菌附着。染色后的菌丝经激光共聚焦显微镜观察,结果表明有较多的细菌存在。GFP-A. faecali SCSIO B001与Spiromastix sp. SCSIO F190进行共培养,观察结果表明在菌丝内部均可以看见含有绿色荧光的亮点存在。同时,荧光原位杂交(FISH)实验也表明在菌丝内部也含有绿色荧光亮点。利用抗生素连续传代培养以及原生质体再生技术处理共生体,得到的单克隆经过PCR验证后发现未能除掉A. faecali SCSIO B001。经过发酵以及共培养的方法,发现细菌A. faecali SCSIO B001能够促进化合物spiromarmycin的生产。2、对菌株Spiromastix sp. SCSIO F190/A. faecali SCSIO B001代谢产物进分离鉴定,得到2个新化合物(1-2)。其中化合物spiromarmycin(1)是可以通过SN1反应发生互变的一对差向异构体。活性测试结果表明,spiromarmycin(1)对20株临床分离的耐药菌株以及家禽耐药细菌具有较好的抗菌活性,MIC在2.0~32.0 μg/mL;对4株耐药菌株Candida albicans,MIC在2.0~32.0 μg/mL,化合物1-2对辣椒疫霉菌Phytophthora capsici(LT1534、P35以及LT263)的IC50在1.5-26.0 μg/mL;化合物1-2对9株植物致病真菌具有较好的活性,其IC50在1.2-31.4 μg/mL。分离得到的化合物有较好的生物活性而且与阳性对照活性相当,具有开发成新型抗生素的潜力。3、同位素喂养实验结果表明,化合物spiromarmycin(1)生物合成前体来源于醋酸单元,通过聚酮生物合成途径进行合成,而且是属于真菌代谢产物中较少见的苯乙酸类聚酮衍生物。通过全基因组测序以及转录组测序校正,确定了化合物spiromarmycin的生物合成基因簇,该基因簇长约68.2 kb,有20个开放阅读框(ORF)。利用米曲霉A. oryzae NSAR1异源表达的方法初步研究了spiromarmycin的生物合成途径,目前已经成功将两个PKS基因Spm5/6进行了异源表达,并从其代谢产物中分离纯化到一个新化合物,中间体(3)。4、Aborycin是一种核糖体肽类化合物家族的I型lasso肽类天然产物。于南海来源链霉菌Streptomyces sp. SCSIO ZS0098中分离鉴定了aborycin。在基因组序列分析的基础上,确定了aborycin生物合成基因簇(abo),并在链霉菌S. coelicolor M1152中成功地进行了异源表达。生物活性测试结果表明:aborycin具有较好的抗菌活性,对15株不同来源Staphylococcus aureus以及Enterococcus gallinarum的MIC在0.5~128 μg/mL。该abo基因簇为改造核糖体肽类化合物以获得更多具有抗菌活性的I型lasso肽类天然产物提供了重要科学基础。本研究为发现研究新型真菌细菌共生体、新菌种以及新型活性天然产物提供了重要的科学依据及物质基础。报道的aborycin生物合成基因簇,为改造lasso肽类化合物产生新型aborycin衍生物提供了理论基础。
Document Type学位论文
Identifierhttp://ir.scsio.ac.cn/handle/344004/18147
Collection学位论文(博士)
Recommended Citation
GB/T 7714
邵明伟. 海洋真菌细菌共生体F190/B001代谢产物及Aborycin生物合成研究[D]. 南海海洋研究所,2019.
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