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石斑鱼真核翻译起始因子2亚基α及其激酶基因的克隆表达和功能分析
Alternative TitleThe clone, expression and functional analysis of eukaryotic initiation factor 2 α subunit and its kinase genes in grouper
臧绍青
Thesis Advisor秦启伟,何毛贤
2019
Degree Grantor南海海洋研究所
Degree Name博士
Degree Discipline海洋生物学
Keyword石斑鱼,eIF2α,HRI,PKR,病毒
Abstract石斑鱼(Epinephelus coioides)是我国重要的经济鱼种,以其味道鲜美,营养丰富而受到青睐。在石斑鱼人工育苗和网箱养殖等技术相继成熟之后,人工养殖得到迅猛发展,但由于养殖规模的不断扩大和养殖环境的日益恶化,造成病毒性疾病的大面积爆发,给石斑鱼养殖业带来了巨大经济损失。目前由于缺乏石斑鱼的遗传信息,所以对石斑鱼免疫系统了解甚少。为了更好的研究分析石斑鱼的免疫机制,我们对真核翻译起始因子2 α亚基(eIF2α)及其激酶的功能进行了初步研究,取得以下研究成果。1. 真核翻译起始因子2 α亚基(eIF2α)是一个关键的翻译调节因子,其磷酸化可显著抑制蛋白质的合成,是细胞对抗外界压力的重要策略,比如病毒感染。本研究中,我们成功克隆了来自石斑鱼eIF2α基因(命名为EceIF2α),分析了其对病毒感染的免疫调节功能。EceIF2α编码315个氨基酸,与橙线雀的eIF2α具有99%的同源性。EceIF2α的结构分析未发现信号肽和跨膜螺旋,其保守的蛋白质合成调节位点位于49位的丝氨酸(Ser-51),该位点也是EceIF2α的磷酸化位点。qRT-PCR分析表明EceIF2α在脾脏,头肾和肾脏中有较高的表达量。当用poly I:C刺激时,EceIF2α在石斑鱼脾脏和头肾中的表达量均有不同程度的增加。在脾脏中于12小时达到最高水平;在头肾中,EceIF2α的转录水平在刺激后12小时至48小时显著增加。EceIF2α在石斑鱼脾脏(grouper spleen,GS)细胞的细胞质和细胞核均有分布。过表达EceIF2α可以明显促进赤点石斑鱼神经坏死病毒(red-spotted grouper nervous necrosis virus, RGNNV)基因在宿主细胞中的转录。报告基因分析显示,EceIF2α抑制NK-κB和IFN-β的活性。促进EceIF2α的磷酸化能显著降低RGNNV 感染后的CP和RdRp的转录水平。2. HRI(the heme-regulated inhabitor)是一种修饰eIF2α磷酸化的酶,即eIF2α激酶。研究表明HRI介导亚砷酸盐压力诱导的eIF2α的磷酸化,抑制蛋白质合成。HRI可以正调节多种细菌病原体特定毒力相关的活性。根据实验室已有的EST序列,我们克隆了来自石斑鱼的HRI基因(命名为EcHRI)。EcHRI编码664个氨基酸,与深裂眶锯雀鲷的HRI进化关系密切。EcHRI在脾脏,头肾和鳃中有较高的表达量。Poly I:C刺激时,石斑鱼脾脏中EcHRI的表达在24 h时达到最高水平。RGNNV感染GS细胞后,EcHRI的表达量于30 h时达到最高水平。亚细胞定位分析表明EcHRI主要分布在GS细胞的细胞核中。过表达EcHR可以抑制RGNNV基因的转录。EcHRI过表达显著增强干扰素(interferon,IFN)的免疫反应和NF-κB(nuclear factor κB)的活性。过表达EcHRI显著提高eIF2α的磷酸化水平。3. PKR(double-stranded RNA dependent protein kinase)是继HRI后发现的第二种eIF2α激酶。PKR氨基末端含有由两个dsRNA结合模体组成的dsRNA结合结构域,由dsRNA和病毒感染所激活。本研究中,我们成功克隆了石斑鱼PKR基因EcPKR。EcPKR编码621个氨基酸,包含两个dsRNA结合模体组成的dsRNA结合结构域。系统发育进化树表明,EcPKR与大黄鱼(Larimichthys crocea)的PKR关系密切。qRT-PCR分析表明EcPKR在脾,肠和鳃中有较高的表达量。当用poly I:C和SGIV刺激时,石斑鱼脾脏中PKR的表达分别在12 h和48 h时达到最高水平。RGNNV感染GS细胞后,细胞中EcPKR的表达量明显增加,相比对照组于36小时达到最高水平。EcPKR主要分布于细胞质中。过表达EcPKR可抑制RGNNV和SGIV基因的转录。过表达EcPKR显著增强干扰素的免疫反应和NF-κB的活性。本研究结果对阐明石斑鱼宿主对病毒免疫应答的分子机制具有重要的科学意义,也为石斑鱼病毒性疾病的预防和治疗提供新的理论依据和潜在靶点。
Document Type学位论文
Identifierhttp://ir.scsio.ac.cn/handle/344004/18176
Collection学位论文(博士)
Recommended Citation
GB/T 7714
臧绍青. 石斑鱼真核翻译起始因子2亚基α及其激酶基因的克隆表达和功能分析[D]. 南海海洋研究所,2019.
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